Sviluppo e caratterizzazione di marcatori e strumenti molecolari per il monitoraggio di esocitosi ed endocitosi nel rimodellamento dell'apoplasto durante la crescita e i meccanismi di difesa

La notevole dinamicità dell’apoplasto dipende dalla funzionalità del sistema di endomembrane. Polisaccaridi di matrice (pectine ed emicellulose) e proteine di parete vengono sintetizzati rispettivamente nei dittiosomi e nel reticolo endoplasmico e raggiungono via vescicole il plasmalemma per essere incorporati nell’apoplasto. Via vescicole arriva al plasmalemma, e qui viene inserito, il complesso cellulosa sintasi. Nonostante l’intenso traffico vescicolare verso l’apoplasto, molto poco si conosce sui meccanismi molecolari alla base di questi eventi. Sembra, comunque accertato il coinvolgimento delle proteine SNARE e di RabGTPasi nel trasporto TGN-membrana plasmatica. Poichè non si conoscono segnali specifici che mediano il trasporto alla membrana plasmatica ed in parete, si pensa che il traffico vescicolare verso lo spazio apoplastico sia un processo di “Bulk flow”. Ciò implica che la membrana plasmatica sia la destinazione di default di materiale polimerico di parete (proteine e polisaccaridi) e di proteine generiche di secrezione. Questo concetto implica che le vescicole non siano selettive e mal si addice alla consapevolezza che l’apoplasto rappresenta un compartimento altamente dinamico e continuamente modulato durante la crescita, il differenziamento e nella risposta a stress biotici e abiotici. Recenti risultati ottenuti dall’UR proponente hanno dimostrato che proteine marker di secrezione generica (secGFP) e polisaccaridi di matrice si muovono attraverso vie secretorie differenti. E’ recente l’idea che la via di secrezione è strettamente correlata al network endocitotico. Le cellule vegetali internalizzano grandi quantità di pectine e arabinogalattano proteine legate da un’ancora di GPI al plasmalemma. Recentemente, è stato dimostrato che il recettore per le flagelline FLS2, presente sulla membrana plasmatica, viene internalizzato in vescicole endocitotiche in seguito a stimolazione da flg22, peptide derivato dalla flagellina batterica. L’unità proponente si prefigge di chiarire il ruolo della secrezione e della endocitosi nel rimodellamento della parete durante i processi di differenziamento associati allo sviluppo e di difesa attraverso l’uso di specifiche proteine marker fluorescenti, inibitori e di mutanti negativi coinvolti negli eventi di riconoscimento e fusione delle vescicole secretorie ed endocitotiche. Il programma prevede la costruzione di marker specifici che permettano di seguire gli eventi di secrezione di proteine coinvolte nel rimodellamento dell’apoplasto e gli eventi di endocitosi nelle risposte di difesa. Si costruiranno fusioni tra GFP e: a) CslAO2 (ipotetica funzione di beta mannano sintasi, localizzazione: Golgi); b) CesA6 (subunità del complesso cellulosa sintasi, localizzazione: membrana plasmatica); c) Air12 (proteina correlata agli eventi di patogenesi, localizzazione: membrana plasmatica), in collaborazione con l’UR IV; d) FLS2 (recettore per le flagelline, localizzazione: membrana plasmatica), in collaborazione con l’UR II; e) EFR (recettore del PAMP Ef-Tu, localizzazione: membrana plasmatica), in collaborazione con l’UR II; f) chimera FLS2/EFR, in collaborazione con l’UR II; e) PAO (Poliammina ossidasi, localizzazione: parete), in collaborazione con l’UR I. Con i costrutti ottenuti si effettueranno espressioni transienti in protoplasti preparati da foglie di tabacco e foglie di piante di tabacco trasformate attraverso agroinfiltrazione. Il pattern di secrezione e di endocitosi dei costrutti verrà seguito attraverso osservazioni di microscopia confocale e avvalorato con analisi di immunoblotting delle proteine solubili, di parete e di membrana. Test con mannosamina (inibitore della sintesi dell’ancora di GPI), tunicamicina (inibitore degli eventi di N-glicosilazione), thyrphostin A23 (inibitore dell’interazione tra le adattine e le proteine cargo) e BFA (inibitore del riciclo fra gli endosomi e la membrana plasmatica) verranno condotti sui protoplasti trasformati con i costrutti ottenuti per stabilire il ruolo di questi eventi nella secrezione all’apoplasto e nell’endocitosi correlata a meccanismi di difesa in risposta a elicitori (OG e flg22). L’unità di ricerca è in possesso di mutanti dominanti negativi (DN) di SYP121 e SYP122 (sintaxine della membrana plasmatica) e di Rab11a e costruirà i mutanti DN di RabA2, RabA3, RabA5 e RabF2. I marcatori fluorescenti verranno testati in presenza dei diversi mutanti DN per verificare se e quali delle SNARE e Rab prese in esame intervengono nella loro secrezione e se alcune Rab intervengono negli eventi di internalizzazione in seguito a stimolazione con flg22 e OG. Per ricercare segnali di targeting specifici per l’apoplasto, verranno effettuate delle fusioni tra GFP e frammenti di PGIP2 e ZmPAO utilizzando la porzione C- ed N- terminale, includendo le porzioni altamente conservate